PCR-RFLP-SSCP及測序用于霍亂弧菌ctx-AB基因多態

　建立PCR-RFLP-SSCP及測序方法，用于分析霍亂弧菌腸毒素AB（ctx-AB）基因多態性。針對ctx-AB基因設計引物，擴增片段為528bp，包括ctx-B編碼基因375bp，引物序列為5′-GGT GTA AAA TTC CTT GAC G-3′和5′-GGT TCG ATG ATG AGA AGC-3′。PCR產物經RsaⅠ酶切為317bp和211bp 2個片段。對酶切產物進行單鏈構象多態性（SSCP）分析，銀染色法顯示結果。對不同SSCP類型測序，利用PCR方法直接對PCR產物測序。

　　霍亂弧菌O1群古典型（CVC）標準株569B和16017，埃爾托型（EVC）標準株919，O139群標準株MO45，EVC80株（廣東省90年代病人分離株），O139群10株（廣東省90年代病人分離株），由廣東省和廣州市衛生防疫站提供。PCR擴增ctx-AB基因，上述菌株均產生1條約528bp的片段，擴增產物經RsaⅠ內切酶消化后，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，均可見1條約317bp的片段和1條約211bp的片段。酶切產物經SSCP分析，分為A和B兩個類型，CVC、EVC和O139群標準株均為A型，80株EVC（廣東省分離株）中8株為A型，其余為B型；O139群（廣東省分離株）均為A型。進一步測序表明兩類型基因序列有3個位點不同，以ctx-B基因的起始堿基定位為1，其下游序列為正，上游序列為負，兩類型在103、115和203位點堿基不同，A型為A、C和C（相應位點編碼的氨基酸為Asp、Tyr和Ile），B型為G、T和T（相應位點編碼的氨基酸為Asn、His和Thr）。與基因庫中霍亂弧菌的ctx-AB基因序列比較，B型103位點與國外報道的序列均不同，可能為廣東地區菌株*的突變。PCR-RFLP-SSCP及測序方法快速、簡便、準確、經濟，適用于對大量標本某重要基因多態性的研究