詳解WB實驗到底需不需要內參抗體

WB實驗是檢測一個基因的表達產(chǎn)物是否正確，或者比較表達產(chǎn)物量的相對變化。Western Blot在有些人眼里做起來很簡單，可實驗不順的時候經(jīng)常會出現(xiàn)做不出結果、假陽性啦、結果出現(xiàn)多條帶等情況。

這到底是一抗有問題還是二抗有問題？所以，嚴謹?shù)腤estern Blot實驗設計中要求有良好的參照體系，對實驗結果分析是非常有用的。

內參即是內部參照，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。

在WB中使用內參其實就是在WB過程中的另外用內參對應的抗體檢測內參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內參的表達，由于內參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。

此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否*、整個WB顯色或者發(fā)光體系是否正常。

實驗結果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進行一次電泳轉膜實驗時，分別檢測樣品的內參量和目的蛋白量。

將各樣品目的蛋白量分別除以其內參含量，得到的數(shù)值即為內參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數(shù)值進行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結果。如果樣品量充分，可以先檢測內參，觀測樣品間內參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調整各樣品的上樣量重新進行Western Blotting實驗，至內參量一致為止；若內參一致，即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。這樣雖然麻煩一點，但是可以保證結果更有說服力，更可信。畢竟我們的實驗是一種嚴謹?shù)墓ぷ鳌?/p>

常用的細胞總蛋白質內參有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin，這其中近的國外文獻報道中使用GAPDH內參的較多。

對于一些植物的樣本，則需要特別的植物Actin蛋白作為內參；同樣的，如果提取的樣本是細胞核蛋白，那么PCNA或者組蛋白H3都是被經(jīng)常使用的；而針對一些研究線粒體的客戶，那么Cox IV則被較多的文獻引用作為線粒體總蛋白的內部參考。