elisa實驗中的包被要注意哪些問題

通常我們在進行Elisa試劑盒的實驗的時候，需要注意一些問題，例如溫育、顯色、包被等。其中，包被是需特別注意的一個問題，直接關系到實驗的效果。那么在實驗的時候包被要注意哪些問題呢？

   首先我們要知道什么是包被。

   在ELISA試劑盒實驗時將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。

   大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。不易吸附的非蛋白質抗原可用間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法。

   親和素生物素  即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發后，讓脂質自然干固在固相表面。

   優點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。

   其次包被主要用哪些。

   1、包被用抗原。

   天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。

   2、包被用抗體

   IgG對聚苯乙烯有強吸附力，其聯結發生在Fc段上，抗體結合點暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性。

   腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。

   后包被需要哪些條件。

   pH9.6碳酸鹽緩沖液

   pH7.2的磷酸鹽緩沖液

   pH7-8的Tris-HCL緩沖液

   加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。