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          小鼠睪酮(T)ELISA試劑盒的應(yīng)用

          2022-09-13 [1586]

          小鼠睪酮(T)ELISA試劑盒的應(yīng)用

          背景[1-3]

          小鼠睪酮(T)ELISA試劑盒用于體外定量檢測(cè)血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中睪酮(T)的含量。


          實(shí)驗(yàn)原理:

          試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被睪酮(T)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的睪酮(T)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),計(jì)算樣品濃度。


          樣本處理及要求

          1、血清:全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

          2、血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C 1000g離心20分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

          3、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:1000g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。


          小鼠睪酮(T)ELISA試劑盒

          操作步驟:

          1、從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

          2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;

          3、樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL;空白孔不加。

          4、除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

          5、棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。

          6、每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

          7、每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。


          小鼠睪酮(T)ELISA試劑盒的應(yīng)用應(yīng)用[4][5]

          用于定坤丹對(duì)大、小鼠前列腺增生模型的影響研究

          探究定坤丹對(duì)大鼠、小鼠前列腺增生的影響作用。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前列腺重量的測(cè)定,計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的前列腺臟器指數(shù),檢測(cè)模型大、小鼠血清中雌激素——雌二醇及雄激素——雙氫睪酮、睪酮含量,檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠前列腺組織勻漿中前列腺酸性磷酸酶活力,觀察堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子及其m RNA、細(xì)胞凋亡基因Bax、Bcl-2等生長(zhǎng)因子在前列腺組織中的表達(dá),從病理學(xué)角度觀察并描述前列腺、腎臟等臟器的微觀改變,基于這些指標(biāo)的變化,綜合性討論定坤丹對(duì)男性常見疾病——前列腺增生的影響作用。


          方法:小鼠模型的復(fù)制:造模小鼠皮下注射丙酸睪酮5mg/kg,每日1次,連續(xù)3周,造前列腺增生模型,同時(shí),每日1次,連續(xù)給藥3周,各組給予相應(yīng)藥物,用等量的溶媒灌服給予模型及空白對(duì)照組,非那雄胺片組給予非那雄胺混懸液(1.25mg/kg),癃閉舒膠囊組給予癃閉舒膠囊混懸液(450mg/kg),大、中、小定坤丹劑量組分別給予大、中、小劑量(10.8g/kg、5.4g/kg、2.7g/kg)的定坤丹混懸液。于末次給藥后2h,小鼠眼眶取血,分離血清,按照試劑盒說明書測(cè)血清中T、DHT、E2水平;取前列腺、附睪、腎等組織,稱重,并計(jì)算相關(guān)臟器指數(shù);光鏡下觀察前列腺、附睪等臟器的組織形態(tài)變化。


          大鼠模型的復(fù)制:摘除大鼠兩邊睪丸以去勢(shì),待一周大鼠自然恢復(fù)后,大鼠給予丙酸睪酮注射液(4mg/kg),每日1次,連續(xù)30d,造前列腺增生模型。模型復(fù)制成功后各組給予相應(yīng)藥物,每日1次,連續(xù)給藥30d:把等量溶媒給予模型及空白對(duì)照組,非那雄胺片組給予0.83mg/kg的非那雄胺混懸液,癃閉舒膠囊組給予300mg/kg的癃閉舒膠囊混懸液,大、中、小定坤丹劑量組分別給予大、中、小劑量(7.2g/kg、3.6g/kg、1.8g/kg)的定坤丹混懸液。


          于末次給藥后2h,眼眶取血,離心,分離血清,按照試劑盒說明書測(cè)血清中T、DHT、E2水平;計(jì)算前列腺指數(shù);測(cè)定前列腺組織勻漿中PACP、NOS、SOD、MDA水平,光鏡下觀察各組前列腺等臟器的形態(tài)變化,觀察前列腺組織中b FGF、TGF-β1、EGF、IGF-Ⅰ、細(xì)胞凋亡基因Bax、Bcl-2及Ki67的免疫組化表達(dá)情況。結(jié)果:丙酸睪酮法誘導(dǎo)非去勢(shì)小鼠前列腺增生模型成功,大、中、小劑量定坤丹組顯著降低小鼠前列腺臟器指數(shù);顯著降低小鼠血清中T、DHT含量,E2含量顯著或明顯升高;顯著改善小鼠前列腺增生病理變化。


          丙酸睪酮法誘導(dǎo)去勢(shì)大鼠前列腺增生模型成功,大、中、小劑量定坤丹組顯著降低大鼠前列腺臟器指數(shù);顯著降低大鼠血清中T、DHT含量,E2含量顯著或明顯升高;大、中、小劑量定坤丹組均可顯著降低模型大鼠前列腺中的PACP活力,顯著升高TNOS、i NOS水平、TGF-β平均光密度,顯著或明顯降低大鼠前列腺M(fèi)DA水平、b FGF、EGF、Bcl-2、Ki-67平均光密度、b FGF m RNA表達(dá),顯著或明顯升高大鼠前列腺SOD活力、Bax平均光密度、TGF-βm RNA表達(dá)。大、中劑量定坤丹組可顯著或明顯降低模型大鼠前列腺中IGF-I平均光密度,小劑量定坤丹組有降低IGF-I平均光密度的趨勢(shì);顯著改善小、大鼠前列腺增生病理變化。


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