研域上海生物為您分享細胞技術分析

細胞技術作為一項生命科學領域的重要技術，想要使用好自然是不容易。相信不少小伙伴在使用幾次之后，還是會有云里霧里的感覺。真正想掌握好一門技術，還是得從基礎部分就做好。

1.如何搭配流式抗體熒光標記？

流式抗體熒光標記搭配主要由3個因素決定：流式細胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測多少個指標、廠家的抗體有多少種熒光標記。流式細胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時檢測的表面/胞內/核內蛋白就越多。以Calibur為例說明：Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488，或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC；Calibur的FL3通道盡管能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個熒光素，但是我們搭配的時候只能選擇其中1個。

2.如果檢測的指標數目超過了流式細胞儀的通道，怎么辦？

如果需要做5個指標，而流式細胞儀只能做4個通道，首先將指標歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測。比如需要同時檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，可以將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8 和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。具體的歸類方式可根據課題的設計來進行。

3.抗體染色的細胞不能立即檢測該如何處理？

如果實驗對細胞活性要求比較高，如凋亡實驗，必須盡快檢測；如果實驗對細胞活性要求不高，可以使用含有4%多聚甲醛的PBS固定樣本30分鐘，固定后的細胞4℃過夜保存，次日檢測。

4.同型對照的作用是什么？

抗體有時會和非抗原結合，可能會因為非特異的蛋白-蛋白相互作用結合細胞內成分，因為疏水作用結合脂肪，也可能會結合一些細胞表面表達的抗體受體。比如，IgG亞型的抗體會結合細胞表面的Fc受體，如CD16、CD32和CD64。理想條件下，各種類型的非特異性結合都可以通過蛋白（BSA、牛奶或動物血清）來阻斷。Fc受體的結合則可以通過與含免疫球蛋白的血清預孵育來阻斷。一個抗體非特異性相互作用和受體結合的情況，可以用無關抗原的相同亞型抗體來比照。