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          研域上海生物為您分享細胞技術分析

          2023-06-27 [940]

          細胞技術作為一項生命科學領域的重要技術,想要使用好自然是不容易。相信不少小伙伴在使用幾次之后,還是會有云里霧里的感覺。真正想掌握好一門技術,還是得從基礎部分就做好。

          1.如何搭配流式抗體熒光標記?

          流式抗體熒光標記搭配主要由3個因素決定:流式細胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測多少個指標、廠家的抗體有多少種熒光標記。流式細胞儀的通道越多,那么同一份樣本能同時檢測的表面/胞內/核內蛋白就越多。Calibur為例說明:Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488,或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC;Calibur的FL3通道盡管能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個熒光素,但是我們搭配的時候只能選擇其中1個。

          2.如果檢測的指標數目超過了流式細胞儀的通道,怎么辦?

          如果需要做5個指標,而流式細胞儀只能做4個通道,首先將指標歸成2類,再將樣本分成2份,分別檢測。比如需要同時檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma,可以將樣本分成兩份,第1份加CD3、CD4、CD8 和IL-4,而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。具體的歸類方式可根據課題的設計來進行。

          3.抗體染色的細胞不能立即檢測該如何處理?

          如果實驗對細胞活性要求比較高,如凋亡實驗,必須盡快檢測;如果實驗對細胞活性要求不高,可以使用含有4%多聚甲醛的PBS固定樣本30分鐘,固定后的細胞4℃過夜保存,次日檢測。

          4.同型對照的作用是什么?

          抗體有時會和非抗原結合,可能會因為非特異的蛋白-蛋白相互作用結合細胞內成分,因為疏水作用結合脂肪,也可能會結合一些細胞表面表達的抗體受體。比如,IgG亞型的抗體會結合細胞表面的Fc受體,如CD16、CD32和CD64。理想條件下,各種類型的非特異性結合都可以通過蛋白(BSA、牛奶或動物血清)來阻斷。Fc受體的結合則可以通過與含免疫球蛋白的血清預孵育來阻斷。一個抗體非特異性相互作用和受體結合的情況,可以用無關抗原的相同亞型抗體來比照。

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