通過噬菌體ELISA鑒定得到的噬菌體克隆

經(jīng)過3～4輪的篩選后，應(yīng)該能夠富集到能與受體特異性結(jié)合的噬菌體群體。通常而言，在后幾輪的篩選中，每次獲得的噬菌體總量都會(huì)增加，但是單就這個(gè)現(xiàn)象并不一定能說明已經(jīng)篩選到了受體特異性結(jié)合的肽段。能與靶分子非特異性結(jié)合或者能與篩選基質(zhì)的噬菌體克隆也會(huì)造成這一現(xiàn)象。噬菌體ELISA可以說是zui靈敏的鑒定所獲取的噬菌體克隆結(jié)合特異性的方法之一。受體被包被在各孔中，與之結(jié)合的噬菌體通過辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗M13噬菌體抗體檢測(cè)。只含有捕獲抗體或者牛血清白蛋白的孔用來作為陰性對(duì)照。作為競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的已知的配體可以加入到噬菌體中來分辨競(jìng)爭(zhēng)性肽和非競(jìng)爭(zhēng)性肽。值得注意的是，這個(gè)實(shí)驗(yàn)所用的條件是為了使檢測(cè)的靈敏度zui大化，而不是基于所展示肽段的內(nèi)在親和性來分辨各個(gè)克隆的。多價(jià)結(jié)合、表達(dá)量的差異以及每個(gè)肽段對(duì)蛋白酶的敏感性都將很大地影響信號(hào)的強(qiáng)弱。
通過噬菌體ELISA鑒定得到的噬菌體克隆
另一個(gè)用來從富集的噬菌體群體中發(fā)現(xiàn)受體特異性克隆的方法是用受體作為探針來檢測(cè)克隆黏附。這是通過將感染了所篩選的噬菌體的細(xì)菌細(xì)胞于LBamp/kan瓊脂糖乎板上培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基含有與液相擴(kuò)增噬菌體相同濃度的葡萄糖和阿拉伯糖。將從細(xì)胞中排出的噬菌體轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜上后，用標(biāo)記了的靶分子探測(cè)（通常是放射性標(biāo)記）。此方法的靈敏度要低于噬菌體ELISA，但是它提供了一個(gè)快速的大規(guī)模分析克隆的方法，并且對(duì)于發(fā)現(xiàn)高親和力的序列可能有作用。
通過噬菌體ELISA鑒定得到的噬菌體克隆
通過對(duì)陽性克隆的p8V5載體的插入DNA片段測(cè)序，將可以推演出對(duì)應(yīng)的肽段序列。

[器材和試劑]
● 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗M13噬菌體抗體（HRP-conjugated anti-M13 antibody）（Amersham Biosciences）
● ABTS顯色緩沖液[50mmol/L檸檬酸，用NaOH調(diào)節(jié)pH至4．0，0．22mg/m1 2，2，-連氮基-雙（3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸）；使用之前加入0．05％的雙氧水]
● Q1agenPlasmidMini Kit試劑盒（Q1agen）
● p8V5反向測(cè)序引物（5，-TGAGGCTT-GCAGGGAGTC-3，）

[方法]
1．從噬菌體滴定平板挑取單克隆，并接種到5mlSOPamp/glu培養(yǎng)基中。于37℃振搖培 養(yǎng)直至OD600值達(dá)到0.5。
2．加入VSC-M13輔助噬菌體（1X109pfu），于37℃靜置孵育30分鐘。
3．加入50tzl 20％阿拉伯糖溶液和5ul 20mg/ml卡那霉素溶液。于37℃振搖培養(yǎng)過夜。
4．于3400r/min轉(zhuǎn)速（臺(tái)式離心機(jī)） 離心細(xì)菌15分鐘，將含有噬菌體的上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。
5．按照實(shí)驗(yàn)方案6．5所述，將受體固定在96孔酶標(biāo)板中。每孔中加入50rdPBS/1％BSA和50ul噬菌體上清，于4℃孵育2小時(shí)。
6．使用PBS洗板5次。用PBS/1％BSA溶液，按1：5000比例稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記 抗M13噬菌體抗體，并于每孔中各加入50/11稀釋液。于4℃孵育1小時(shí)。
7．使用PBS洗板5次。于每孔中加入100ul ABTS顯色緩沖液，室溫孵育直至顏色顯現(xiàn)。用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm波長時(shí)的吸光度。
8．按照廠商說明書，用QiagenPlasmidMiniKit試劑盒抽提在ELISA反應(yīng)中顯陽性的噬菌體雙鏈DNA。按雙脫氧測(cè)序法ti4]使用p8V5反向測(cè)序引物測(cè)定DNA序列。