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          通過噬菌體ELISA鑒定得到的噬菌體克隆

          2011-10-18 [2526]

          通過噬菌體ELISA鑒定得到的噬菌體克隆

          經(jīng)過3~4輪的篩選后,應(yīng)該能夠富集到能與受體特異性結(jié)合的噬菌體群體。通常而言,在后幾輪的篩選中,每次獲得的噬菌體總量都會(huì)增加,但是單就這個(gè)現(xiàn)象并不一定能說明已經(jīng)篩選到了受體特異性結(jié)合的肽段。能與靶分子非特異性結(jié)合或者能與篩選基質(zhì)的噬菌體克隆也會(huì)造成這一現(xiàn)象。噬菌體ELISA可以說是zui靈敏的鑒定所獲取的噬菌體克隆結(jié)合特異性的方法之一。受體被包被在各孔中,與之結(jié)合的噬菌體通過辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗M13噬菌體抗體檢測(cè)。只含有捕獲抗體或者牛血清白蛋白的孔用來作為陰性對(duì)照。作為競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物的已知的配體可以加入到噬菌體中來分辨競(jìng)爭(zhēng)性肽和非競(jìng)爭(zhēng)性肽。值得注意的是,這個(gè)實(shí)驗(yàn)所用的條件是為了使檢測(cè)的靈敏度zui大化,而不是基于所展示肽段的內(nèi)在親和性來分辨各個(gè)克隆的。多價(jià)結(jié)合、表達(dá)量的差異以及每個(gè)肽段對(duì)蛋白酶的敏感性都將很大地影響信號(hào)的強(qiáng)弱。
          通過噬菌體ELISA鑒定得到的噬菌體克隆
          另一個(gè)用來從富集的噬菌體群體中發(fā)現(xiàn)受體特異性克隆的方法是用受體作為探針來檢測(cè)克隆黏附。這是通過將感染了所篩選的噬菌體的細(xì)菌細(xì)胞于LBamp/kan瓊脂糖乎板上培養(yǎng),其中培養(yǎng)基含有與液相擴(kuò)增噬菌體相同濃度的葡萄糖和阿拉伯糖。將從細(xì)胞中排出的噬菌體轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜上后,用標(biāo)記了的靶分子探測(cè)(通常是放射性標(biāo)記)。此方法的靈敏度要低于噬菌體ELISA,但是它提供了一個(gè)快速的大規(guī)模分析克隆的方法,并且對(duì)于發(fā)現(xiàn)高親和力的序列可能有作用。
          通過噬菌體ELISA鑒定得到的噬菌體克隆
          通過對(duì)陽性克隆的p8V5載體的插入DNA片段測(cè)序,將可以推演出對(duì)應(yīng)的肽段序列。

          [器材和試劑]
          ● 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗M13噬菌體抗體(HRP-conjugated anti-M13 antibody)(Amersham Biosciences)
          ● ABTS顯色緩沖液[50mmol/L檸檬酸,用NaOH調(diào)節(jié)pH至4.0,0.22mg/m1 2,2,-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸);使用之前加入0.05%的雙氧水]
          ● Q1agenPlasmidMini Kit試劑盒(Q1agen)
          ● p8V5反向測(cè)序引物(5,-TGAGGCTT-GCAGGGAGTC-3,)

          [方法]
          1.從噬菌體滴定平板挑取單克隆,并接種到5mlSOPamp/glu培養(yǎng)基中。于37℃振搖培 養(yǎng)直至OD600值達(dá)到0.5。
          2.加入VSC-M13輔助噬菌體(1X109pfu),于37℃靜置孵育30分鐘。
          3.加入50tzl 20%阿拉伯糖溶液和5ul 20mg/ml卡那霉素溶液。于37℃振搖培養(yǎng)過夜。
          4.于3400r/min轉(zhuǎn)速(臺(tái)式離心機(jī)) 離心細(xì)菌15分鐘,將含有噬菌體的上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。
          5.按照實(shí)驗(yàn)方案6.5所述,將受體固定在96孔酶標(biāo)板中。每孔中加入50rdPBS/1%BSA和50ul噬菌體上清,于4℃孵育2小時(shí)。
          6.使用PBS洗板5次。用PBS/1%BSA溶液,按1:5000比例稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記 抗M13噬菌體抗體,并于每孔中各加入50/11稀釋液。于4℃孵育1小時(shí)。
          7.使用PBS洗板5次。于每孔中加入100ul ABTS顯色緩沖液,室溫孵育直至顏色顯現(xiàn)。用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm波長時(shí)的吸光度。
          8.按照廠商說明書,用QiagenPlasmidMiniKit試劑盒抽提在ELISA反應(yīng)中顯陽性的噬菌體雙鏈DNA。按雙脫氧測(cè)序法ti4]使用p8V5反向測(cè)序引物測(cè)定DNA序列。

           

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