PCR-ELISA法診斷禽流感

PCR-ELISA法診斷禽流感
PCR-ELISA是將一步RT-PCR技術與酶聯免疫吸附法相結合，檢測病毒的一項診斷技術。PCR的一對引物中，其中一個用生物素標記、另一個用地高辛標記，在酶標微孔板上用親和素包被，PCR擴增后純化片段加入微孔板中。此時，微孔板上包被的親和素將與生物素標記引物上的生物素特異性結合而捕捉了PCR片段，然后在微IL板中加入辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，該抗體將與地高辛標記引物上的地高辛結合，從而形成親和素-生物素-PCR片段-地高辛-地高辛抗體-辣根過氧化物酶復合物。加入酶的相應底物進行顯色，便可判斷PCR擴增的有無。由于該方法是PCR和ELISA技術的結合，所以它是一種兩級放大系統、靈敏度更高。同時這種方法避免了PCR產物分析時，電泳的電極及染色過程，所以更為快捷、簡便和靈敏。丹麥學者MMunch等建立的RT-PCR-ELISA方法，比常規RT-PCR敏感10～100倍，1個毒株（EID50＝10-84）的感染性尿囊液經10-7稀釋仍能檢出，與雞胚病毒分離的敏感性一致。
PCR-ELISA法診斷禽流感
國內亢文華等針對高致病性禽流感H5亞型病毒的包含多堿性氨基酸裂解位點特異性片斷，設計用生物素和地高辛標記的特異性引物，從活禽咽拭子、肛拭子、糞便及病死禽組織病料中擴增標記RT-PCR產物，再以ELISA方法，用生物親和素包被的微量板孔中雜交捕獲RT-PCR產物·，再在微孔板中加入辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，該抗體將與另一引物上的地高辛結合，從而形成生物親和素-生物素-PCR片段-地高辛-抗地高辛抗體-酶的復合物。加入酶的相應底物進行顯色，便可判斷PCR擴增的有無。由于該方法是PCR技術和ELISA技術的結合，所以它是一種兩級放大系統，即PCR放大和ELISA放大，試驗證實它的靈敏度已經超過雞胚分離法（熒光PCR檢出的zui低稀釋度為10-6.67，雞胚分離檢出的zui低稀釋度為10-7.67，PCR-ELtSA檢出的zui低稀釋度為10-8.8），證明本方法具有較高的敏感性，比普通PCR和熒光PCR更為快捷、簡便、靈敏，同時這種方法避免了PCR產物分析時的電泳及染色過程。
PCR-ELISA法診斷禽流感