哺乳動物細胞的RNAi技術策略

哺乳動物細胞的RNAi技術策略
目前RNAi技術已經進入了生物科學研究的許多領域，成為了一種主要的生物學研究工具，發(fā)展得相當迅速，并受到了此次諾貝爾獎評審委員會的青睞，獲得2006年諾貝爾獎醫(yī)學/生理獎。然而這一才歷經十個年頭的技術依然對于許多研究人員來說還是很陌生的，以下是有關RNAi技術在哺乳動物細胞中應用的具體設計策略，主要來自于《遺傳》雜志2005年“RNA干涉（RNAi）技術應用于哺乳動物細胞的研究策略”，希望能給從事或者準備從事RNAi相關實驗的研究人員以幫助。
哺乳動物細胞的RNAi技術策略
一、靶siRNA序列選擇
靶siRNAA序列選擇是RNAi實驗成敗的關鍵。哺乳動物細胞RNAi實驗中，使用zui廣泛且zui有效的是21bp siRNA。siRNA由正義鏈和反義鏈組成，兩條鏈3’端均有2個堿基突出，一般為UU或dTdT，其中正義鏈的前19nt與靶基因序列相同。
1. siRNA設計的原則
SiRNA雙鏈設計時，一般在靶mRNA起始密碼下游100—200bp至翻譯終止密碼上游d0—100bp的范圍內搜尋AA序列，并記錄每個AA3’端相鄰19個核苷酸作為候選si.RNA靶位點。其中AA（N19）TT是的序列，若靶mRNA中無此序列，亦可選用NA（N21）或NAR（N17）YNN（R表示嘌呤，Y表示嘧啶），但在合成時，siRNA的正義鏈3’端需用dT—dT代替。TuscRl等建議設計的siRNA不要針對mRNA的5’和3’端非編碼區(qū)，因為這些區(qū)域有豐富的調控蛋白結合位點，而UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP（siRNA protein complex，核酸內切酶復合物）結合mRNA，從而影響siRNA干擾的效果。zui后還應將候選siRNA序列在GenBank進行BLAST檢索，與非同源基因具有3個或哺乳動物細胞的RNAi技術策略
3個以上堿基相異的序列方可選用。
2. siRNA的序列結構特征
除了靶序列位點的選擇，siIRNA序列本身結構特征亦會影響到RNAi效率。RNAi實質上可視為一個RNA與蛋白質互作過程，包括siRNA與RISC結合、RISC的激活以及RISC與靶mRNA的結合和切割，這種互作效應的存在，往往造成siRNA鏈的選擇具有偏愛性。Reynolds等通過對2個基因的180條siRNA序列分析，歸納出以下8個與siRNA性相關的特征:G/C含量低（30%-52%），正義鏈3’端具較低穩(wěn)定性（有利于siRNA與RISC的結合和解鏈），無反向重復序列（有利于減小siRNA的有效作用濃度，提高siRNA干擾效率），正義鏈堿基的偏愛性A19（正義鏈中第19位堿基為A，如下表示類同）；A3；U10；無G/C（正義鏈中第19位堿基不為G或C）；無G13。依此規(guī)則，Reynolds等設計的30條siRNA中有29條是有效的。Kumiko等亦認為siRNA反義鏈5’端為A/U（即有義鏈U/A）19和zui后7個堿基中有5個A/U，會有助于RNAi的發(fā)揮，且正義鏈G/C1和序列中無連續(xù)9nt以上的GC重復片段與基因沉默效率呈顯著相關。有趣的是，該實驗還表明這些規(guī)則同樣適用于DNA介導的RNAi（DNA-based RNAi.）實驗。此外，Amarzguioui等發(fā)現(xiàn)正義鏈5’與3’端的前3個堿基中A/U含量不對稱（3’端含量應高一些）和A6對siRNA 的活性亦影響很大。根據上述結果，可以初步繪制出一個siRNA序列結構的精細與簡略示意圖。

現(xiàn)已知道siRNA的反義鏈決定著靶位點識別，那么在不影響siRNA作用功效的前提下，是否可以對其正義鏈堿基作適當更改或修飾呢？Amarzguioui等研究siRNA不同部位對堿基突變和化學修飾的耐受性，認為siRNA的5’端相對于3’端具有對突變的較高耐受性。有學者認為正義鏈3’突出端的任何堿基修飾對siRNA作用效果均無明顯影響。還有學者認為與反義鏈互補的正義鏈3’端發(fā)生1—4個堿基的錯配反而有助于增強RNAI的活性。
二、siRNA制備方法
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括
化學合成
體外轉錄
長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 （e.g. Dicer, E. coli, RNase III）
siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs
PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達
前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經過轉染或者電轉導入哺乳動物細胞后面兩種方法則依賴能夠表達siRNAs的DNA載體或者表達框轉染到細胞中。每種方法都有自己的優(yōu)點和缺點。哪種是的方法，其實取決于實驗目的。這里簡單介紹這5種方法，優(yōu)點和缺點，以及它們的應用。
siRNA的設計
除了方法3以外，其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列。關于怎樣設計siRNA以及siRNA設計對siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來越多有關設計原則的信息。但這仍然不是的。通常來說，每個目標序列設計3—4對siRNAs，在后面的實驗中選擇zui有?的那個。網上有提供免費的siRNA設計工具。
體外制備
1.化學合成
盡管化學合