ELISA檢測試劑盒方法之雙抗體夾心法測抗原

      我們曾使用本室能得到的含最高濃度(約2mg／m1)HBsAg的血清樣本對目前國內較大的試劑生產廠家的“一步法"HBsAg測定ELISA檢測試劑盒的“鉤狀效應"進行了評價，盡管大部分有在HBsAg最高濃度下的測定顯色較次高濃度(1：lo稀釋)顯色要淺的現象，但均未出現該份樣本測定為陰性的情況。盡管如此，在臨床實際工作中，仍有可能遇到“鉤狀效應"較嚴重的HBsAg測定ELISA檢測試劑盒，我們也經常聽到基層實驗室同行在這方面的反映。

      而一步法雙抗夾心ELISA檢測試劑盒的反應曲線則為鐘形曲線(圖2—3)。也就是說測定顯色隨著待則標本中抗原濃度的增加而升高至一定程度后，測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色，即所謂的“鉤狀效應"(hook eHect)，也就是我們在免疫沉淀試驗中所稱的“帶現象"(zonephen。menon)。一步法的反應平衡式如(3)式

       此外，b和c復合物的增加亦使得“雙抗體夾心復合物"難以形成。但如果 固相單抗和標記單抗采用針對抗原的不同且空間距離較遠的決定簇的抗體，即包被使用一種 單抗，酶標記使用另一種單抗，同時充分混勻反應液，并適當延長反應溫育時間，則可使b，。和 d復合物減少至程度，而大大減輕“鉤狀效應"。

       綜上所述，一步法ELISA檢測試劑盒作為迎合臨床實驗室簡便快速要求的產物，有著巨大的市場，其雖有潛在缺陷，易導致含高濃度待測物的標本檢測為陰性(假陰性)，但精心的實驗設計，對包被和酶標記抗體仔細選擇，“鉤狀效應"出現的可能性降至。此外，建議生產HBsAg，aFP和hCGELISA"一步法"測定ELISA檢測試劑盒的廠家，應對所產的試劑在出廠前對其“鉤狀效應"(hookeffect)進行充分的研究，并提醒用戶在使用時應注意之處。

       因此，大家還應該重視這方面的問題·，當發現測定結果明顯與臨床不符或與相關測定指標互有矛盾，如HBeAg陽性樣本HBsAg測定為陰性時，就應考慮HBsAg測定可能存在的“鉤狀效應"問題。在通常的兩步溫育洗滌方法中，抗原抗體反應將遵循下述規律，即在第一步中加入的待測標本中抗原(Ag)濃度逐步增加時，將使固相抗體(Ab)與抗原的結合逐步達到飽和[(1)式]，這樣當隨后加入一定濃度的酶標抗體(Ab’)后，a復合物的形成將直接與在第一步中形成的b復合物相關[(2)式]，因此，待測抗原濃度的逐步增加導致了顯色的逐步加深，當抗原濃度增加到一定程度時，反應顯色達到平臺，而呈S形變化曲線。