小鼠ELISA試劑盒實驗操縱規則

       小鼠ELISA試劑盒法是免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經使用的結果，以為小鼠ELISA試劑盒法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操縱等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。

可概括四個方面： 

1、免疫酶染色各種細胞內成份的定位。 

2、研究抗酶抗體的合成。

 3、顯現微量的免疫沉淀反應。

 4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。

基本方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法: 

1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。越日，棄往孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。 

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空缺孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。 

3.　加酶標抗體：于各反應孔中，加進新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。 

4.　加底物液顯色：于各反應孔中加進臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。 

5.　終止反應：于各反應孔中加進2M硫酸0.05ml。 

6.　結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號表示。也可測O·D值：在小鼠ELISA試劑盒檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空缺對照孔調零后測各孔O·D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

基本方法二　用于檢測未知抗體的間接法： 

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃過夜。越日洗滌3次。 

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加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空缺、陰性及陽性孔對照) 

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于反應孔中，加進新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,后一遍用DDW洗滌。 

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其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。

（二） 酶與底物

       酶結合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯劑作用下聯結的產物。是 小鼠ELISA試劑盒成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。