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          人前列腺素E2(PGE2)酶聯免疫試劑盒使用說明書

          2013-08-02 [1869]

          酶聯免疫試劑盒試驗原理:
          GMP-140試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA).已知GMP-140濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將GMP-140和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中GMP-140的濃度呈比例關系。

          試劑盒內容及其配制

          試劑盒成份(2-8℃保存)96孔配置48孔配置配制
          96/48人份酶標板1塊板(96T)半塊板(48T)即用型
          塑料膜板蓋1塊半塊即用型
          標準品:400ng/ml1瓶(0.6ml)1瓶(0.3ml)按說明書進行稀稀
          空白對照1瓶(1.0ml)1瓶(0.5ml)即用型
          標準品稀釋緩沖液1瓶(5ml)1瓶(2.5ml)即用型
          生物素標記的抗GMP-140抗體1瓶(6ml)1瓶(3.0ml)即用型
          親和鏈酶素-HRP1瓶(10ml)1瓶(5.0ml)即用型
          洗滌緩沖液1瓶(20ml)1瓶(10ml)按說明書進行稀釋
          底物A1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型
          底物B1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型
          終止液1瓶(6.0ml)1瓶(3.0ml)即用型
          標本稀釋液1瓶(12ml)1瓶(6.0ml)即用型

          自備材料
          蒸餾水。
          加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
          振蕩器及磁力攪拌器等。

          安全性
          避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
          實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
          不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

          酶聯免疫試劑盒操作注意事項
          試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
          實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
          不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
          使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
          使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
          洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
          底物A應揮發,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
          加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
          按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

          樣品收集、處理及保存方法
          血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
          血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
          細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
          組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液
          保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

          試劑的準備
          標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:

          400 ng/ml(6號標準品)原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
          200 ng/ml(5號標準品)100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
          100 ng/ml(4號標準品)100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
          50 ng/ml(3號標準品)100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
          25 ng/ml(2號標準品)100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
          12.5 ng/ml(1號標準品)100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
          0 ng/ml(空白對照)原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

          洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。


          操作步驟
          使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。
          根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應孔內。
          加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
          甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
          每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
          甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
          每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
          取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。
          在450nm波長處測定各孔的OD值。

          建議使用的實驗方案

          標準品濃度(ng/ml)
          A400400樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
          B200200樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
          C100100樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
          D5050樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
          E2525樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
          F12.512.5樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
          G00樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
          H樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品


          局限
          6號標準品以上的結果為非線性的,根據此標準曲線無法得到的結果。

          試劑盒性能
          1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
          2. 特異性:不與其它細胞因子反應。
          3. 重復性:板內、板間變異系數均小于10%。

          酶聯免疫試劑盒結 果 判 斷 與 分 析
          1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

          2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的GMP-140標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的GMP-140含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

          3、檢測值范圍:0-400ng/ml

          4、敏感度: 1.0 ng/ml

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