ELISA試劑盒實驗操作中常見問題明細

由于ELISA試劑盒具有靈敏度較高、特異性好的特點，已廣泛應用于各種傳染性疾病的篩查如肝炎、愛滋、優生優育等。雖然洗板只是ELISA 實驗 重要環節中的一個，但作為專業的洗板機生產廠家，我們必須對影響ELISA 實驗 結果各因素有一定的認識。的試劑 ，良好的儀器和正確的操作是保證 ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件。如不注意，就易出現白板、花板、色弱和假陽性等現象。尤其是花板現象（就是空白、陰性、陽性對照以及室內質控孔結果正常，而標本孔的OD 值卻明顯偏高）是各個廠家洗板機調試中經常遇到的問題?，F將ELISA 實驗操作中注意事項總結如下，以期給大家帶來一些啟發，以改善洗板機的安裝調試水平，提高臨床檢測質量。
1 標本及采集、貯運因素
（1）嚴重溶血 ，以 HRP 為標記的ELISA試劑盒測定中，殘留在孔內的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽性；
（2）混有紅細胞的血清 易沉淀或附著在聚乙烯孔內不易洗凈；
（3）如有細菌污染 ，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應；
（4）標本凝固不全 ，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA 測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；
（5）采血試管洗滌不* 、反復使用易交叉污染；
（6）塑料試管能吸附抗原物質 ，樣本久置在塑料管內會使樣本內抗原含量下降造成假陰性。
血清標本宜在新鮮時檢測，嚴重溶血標本禁用。一般說來，在 5 天內測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需－20℃保存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存；使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD 值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷能吸附酶標記物不易洗脫有關；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA 系統中辣根過氧化物酶活性；血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當的促凝劑。
2、試劑的影響
ELISA 診斷試劑經歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。由于歷史的原因，人們往往以反應本底的好壞來衡量ELISA反應試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學敏感度不夠，穩定性也成問題。也有廠家堅持試劑盒高的流行病學敏感度，科學地對待反應結果?；蚬こ炭乖^合成肽抗原有*的*性，就 HCV-ELISA 試劑盒來講，*代產品為合成肽抗原，主要是HCV 特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當時的基因工程抗原不全，僅包括了HCV 的核心區片段；第三代產品基本上采用了 基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩定、純度更高的HCV 特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了。
基因工程抗原與合成肽抗原的區別如下：
基因工程抗原是抗原基因在質粒載體中原核或真核表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達系統。該類抗原與合成肽相比具有以下特點：
a.分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數量有限，只能達到數百個氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。
b.穩定性好。包被的抗原的穩定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的 試劑 盒效期只有3-4 個月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。
c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達，表達產物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。
d.純化難度大。基因工程抗原的純化技術難度較大。
合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點：
a.分子量太?。?br />b.一般只含有一個抗原決定簇；
c.純度高；
d.穩定性差。
國內乙肝兩對半試劑廠家較多；不同廠家出產的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為 89.4%—99.3%,78%—89%存在較大差異。有的廠家酶標板孔間A 值差大于15%；標記酶的活性及顯色液的穩定比較差。使用質劣的試劑必然導致結果的假陽性或假陰性。因此。選擇高質量的試劑是保證結果準確的關鍵之一。 1） 選擇試劑時應選擇靈敏度高、特異性好、穩定性好、批間差小、操作方便省時的優良檢測試劑，國家參比實驗室每年對各廠家的試劑進行質量評估并定期公布評估結果，可作為選擇試劑的主要依據。 2） 要注意試劑的批號和出廠日期，雖然試劑的有效期多為 1 年。選擇剛出廠的試劑使用。 不同廠家的試劑不能混用。 不同方法學的檢測試劑，會使兩對半結果出現一些不同。例如：在實際工作中常用 ELISA 檢測HBsAg 結果為陰性，而電化學發光檢測為陽性。除方法學的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對變異抗原或亞型乙肝標志物檢測存在差異，建議試劑廠家對劑的制備應該考慮亞型及型濃度的問題。
3、操作技術的影響
操作過程的控制：
（1）嚴格按照試劑說明書進行操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min。
（2）加樣后及時放人孵箱。標本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗*。
（3）封板溫育時，各孔一定要封嚴，防止陽性標本的液體蒸發，產生周邊現象從而導致“花板”的出現。
（4）用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產生拖帶現象而導致“花板”的出現。
（5）合理安排檢測量，以免反應板過多造成洗板等待時間長。
（6）加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。
（7）顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB 顯色劑不用。
（8）加樣時保持顯色劑不外流；A、B 液應避免接觸金屬器械。加終止液時應避免產生氣泡。
（9）應保證酶標板清潔，整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。
以上的措施可以使“花板”降至zui低限度。ELISA試劑盒從而提高檢測的特異性。并得到更準確、可靠的 實驗結果。