首頁 > 技術文章 > 小鼠脾臟樹突細胞的分離-膠原酶消化制備脾臟細胞懸液

          小鼠脾臟樹突細胞的分離-膠原酶消化制備脾臟細胞懸液

          2010-07-16 [2942]
          輔助方案:
          膠原酶消化制備脾臟細胞懸液
           
          實驗材料:
          1.    4000U/ml膠原酶D,融化后置于冰上
          2.    HBSS,已滅菌,含Ca+、Mg2+(購置于Life Technologies)
          3.    小鼠脾臟
          4.    皮下注射針,22G×11/2in內徑(Becton Dickinson)
          5.    10ml、5ml一次性注射器(如Becton Dickinson)
          6.    100mm直徑培養皿(如Falcon)
          7.    2個高壓滅菌鍋的鋸齒狀解剖鑷(如Roboz)
          8.    高壓滅菌的不銹鋼網:將40目的不銹鋼網剪成5cm×5cm的小方格,向下折疊邊緣,然后將四邊彎成淺的矩形碗;錫箔紙包裹后高壓滅菌。
           
          實驗方法:
          1.    將2管1ml的4000U/ml膠原酶D稀釋(足夠用于20個脾臟):1ml加入9ml HBSS(稀釋至4000U/ml,步驟8使用),1ml加入39ml的HBSS(稀釋至100 U/ml)。置于冰上。
          2.    將22G針頭連接在10ml的注射器上,充滿100 U/ml的膠原酶。將10ml的100 U/ml溶液加入100mm的培養皿中。
          3.    取另外一個直徑100mm的培養皿進行操作。一只手拿鑷子,另一只手拿注射器,拇指放在活塞上。用鑷子夾住小鼠脾臟,用針頭刺入脾臟被膜的狹窄邊緣,注入100 U/ml膠原酶100ml。用鑷子將脾臟推向針頭,使針頭前進幾毫米。重復注射膠原酶,繼續直到1ml膠原酶都注射入脾臟,針頭從另一端刺穿脾臟。
          4.    用針頭撕開脾臟,將其轉移至含膠原酶的培養皿中(步驟2)。重復操作,直到所有脾臟都注射和撕開。
          5.    從第二個培養皿中收集細胞懸液加入到置于冰上的50ml離心管中。用3ml 100 U/ml的膠原酶漂洗培養皿后加到上述50ml離心管中。
          6.    加入3ml 100 U/ml膠原酶至培養皿中。將撕碎的脾臟依次轉移至培養皿。用2個鑷子將它們撕成邊長1mm的小碎塊,使其能通過5ml吸管的內徑。當所有的脾臟都撕碎后,將先前放置脾臟碎塊的培養皿中的膠原酶溶液加入進來,用5ml吸管猛烈吹打多次。
          7.    傾斜培養皿,將大塊碎片除開,將細胞懸液轉移至第5步的置于冰上的50ml離心管中。用幾毫升100 U/ml的膠原酶洗滌培養皿后加入至離心管中。
          8.    在培養皿留下的脾臟碎塊中加入10ml 400 U/ml的膠原酶。吹打數次后于培養箱里放置30-90min。
          9.    在孵育的zui后階段,猛烈吹打碎片,將其吸至直徑100mm培養皿的無菌鋼網上。
          10.    用鑷子固定鋼網一端,用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌碎塊,然后用無菌的5ml注射器活塞碾磨碎塊。搗爛直到所有的紅色物質從組織中去除。再用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌鋼網。
          11.    將鋼網從培養皿中拿開,丟棄無色的黏附的被膜碎塊。猛烈地吹打培養皿中的液體,將其轉移至步驟7的50ml離心管里。用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌培養皿后一同加入到離心管中(約有0.5%為樹突細胞或者更少)。
          12.    如果需要,即可用高密度的BSA離心。
           
          附錄:
              抗體偶聯的綿羊紅細胞(EA):
          以PBS洗滌2.5ml收集的綿羊紅細胞(Alsever液中提取;Cocalico)3次,每次洗滌后均以350g離心5min。然后用新鮮PBS稀釋為5%細胞懸浮液(109個細胞/ml)。將高致敏的兔抗紅細胞血清于5%細胞懸液以1:50稀釋(可能形成亞凝集劑量的抗體)。室溫下孵育2h,偶爾溫和地顛倒溶液。用RPMI1640(Life Technologies)洗滌形成的EA3次,隨后以PBS將EA稀釋為5%細胞懸液。于4℃保存2周,使用前再以RPMI洗滌一次。
           
              RPMI-5*培養基:
                  RPMI1640培養基(Life Technologies),含有:
                  5%FBS,56℃熱滅活1h
                  10mmol/L HEPES
                  20mg/ml硫酸慶大霉素(Life Technologies)
                  50mmol/ml 2-ME
                  過濾除菌
           
               高密度BSA溶液:
          在1L容量瓶中,加入186ml PBS,29ml 1mol/L NaOH,65ml水(小心操作,注意液體不要再瓶內飛濺)。不要攪拌,將106g BSA(Cohn fraction V,推薦采用*BSA)鋪在溶液表面,蓋上錫紙,冷藏過夜,使BSA慢慢溶解。
          第二天,溫和搖晃已變為澄清、微褐色的溶液;測量折射指數,到小數點后第四位。25℃條件下,正確密度的BSA(1.080g/ml)的折射指數在1.384-1.385。為校正折射指數后,用試紙檢測pH。pH應在7.0-7.4,一般無需調整。
          無菌過濾溶液。將47mm濾膜(Millpore type)置于一個500ml的過濾裝置(Nalgene#156-4045)頂部,先以少量BSA潤濕濾膜。真空抽濾數分鐘,直到BSA濾出為止。取下真空泵,小心將剩余的BSA溶液加入濾器上部的儲存器中(避免起泡沫。使用真空泵和濾器過濾剩余的BSA,≥10min)。4℃可保存3個月。


          主站蜘蛛池模板: 国产成人无码av片在线观看不卡 | 亚洲av成人综合网| 国产成人年无码AV片在线观看| 国产成人无码一区二区三区| 久久精品成人一区二区三区| 青青国产成人久久91| 成人免费无码大片a毛片软件| 免费无码成人AV在线播放不卡| 香蕉视频成人在线观看| 国产成人小视频| 成人理论电影在线观看| 国产成人亚洲综合| 最新69堂国产成人精品视频| 亚洲国产成人精品无码区在线观看| 成人影院wwwwwwwwwww| 亚洲av午夜成人片| 国产成人做受免费视频| 成人免费视频网| 久久成人国产精品| 亚洲成人高清在线观看| 国产成人无码区免费内射一片色欲| 成人综合久久综合| www夜片内射视频日韩精品成人| 成人免费激情视频| 色窝窝无码一区二区三区成人网站 | 四虎影视永久地址www成人| 成人毛片100免费观看| 香蕉视频成人在线观看| 亚洲国产成人无码av在线影院| 国产成人av在线影院| 国产成人综合久久精品红| 成人国产在线观看高清不卡| 18级成人毛片免费观看| 久久精品成人无码观看56| 亚洲国产精品一区二区成人片国内| 国产成人www| 亚洲天堂成人网| 久久成人午夜电影mp4| 欧美成人综合在线| 成人无码午夜在线观看| 成人片黄网站色大片免费|