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          細胞培養常見問題及回答

          2010-07-30 [1781]

          1.如何選用培養基?
             
          培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEMM199中同樣很容易生長。總之,MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養,各種目的無血清培養的是AIM V培養基(SFM)。
           2.
          為什么要熱滅活血清?
             
          加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。

          3.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?
               L
          -谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有zui終確定。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

          4.GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?
               GlutaMAX-I
          二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,將其不穩定的α-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。
              GlutaMAX-I
          二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I二肽溶液有zui小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎*降解。

          5.為什么培養基中可以省去加酚紅?
              
          酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。

          6.如何用臺盼蘭計數活細胞?
              
          用無血清培養基把細胞懸液稀釋到2002000/毫升,在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。

          7.如何消除組織培養的污染?
             
          當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。
             
          高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。
          1)
          在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。
          2)
          分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.250.501.02.04.0,8.0 mg/ml
          3)
          每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。
          4)
          確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度23倍濃度的抗生素的培養液培養細胞23代。
          5)
          在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
          6)
          重復步驟4
          7)
          在無抗生素的培養基中培養46代,確定污染是否以已被消除。

          8.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?
             
          丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

          9.Hanks 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hanks 平衡鹽溶液(HBS)和Earles平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別?
               HBS
          EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。

          10.Qualified Certified 胎牛血清有什么差別?
              Certified
          胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序,而且除了這些標準檢測,Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測:
          End-Point Determination of Endotoxin Content
          噬菌體檢驗
          生物化學檢測
           
          激素的檢測
          血紅蛋白檢測
          Sf9
          細胞生長促進及方法學檢測

          11.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?
              
          二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。

          12.制備 lipid-DNA的方法會影響轉染效率嗎?
              
          對于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中,稀釋DNA100μl OPTI-MEM

           

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