微生物染色的基本原理

微生物染色的基本原理：是借助物理因素和化學因素的作用而進行的。物理因素如細胞及細胞物質對染料的毛細現象、滲透、吸附作用等。化學因素則是根據細胞物質和染料的不同性質而發生地各種化學反應。酸性物質對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩固；同樣，堿性物質對酸性染料較易于吸附。如酸性物質細胞核對于堿性染料就有化學親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發生。相反，堿性物質（如細胞質）通常僅能染上酸性染料，若把它們變為適宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發生吸附作用。

影響染色的其它因素，還有菌體細胞的構造和其外膜的通透性，如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結構完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養基的組成、菌令、染色液中的電介質含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細菌的染色。

染料的種類：染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質，分為酸性染料、堿性染料和中性（復合）染料三大類。

1、酸性染料：這類染料電離后染料離子帶負電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苦味酸和酸性復紅等，可與堿性物質結合成鹽。當培養基因糖類分解產酸使pH值下降時，細菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染色。

2、堿性染料：這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質結合成鹽。微生物實驗室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結晶紫、堿性復紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等，在一般的情況下，細菌易被堿性染料染色。

3、中性（復合）染料：酸性染料與堿性染料的結合物叫做中性（復合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細胞核的染色。

瑞氏染液及其配制

1、瑞氏染料是由堿性染料美藍（Methvlem blue和酸性染料伊紅（EostmY）合稱伊紅美藍染料即瑞氏（美藍－伊紅Y）染料。

伊紅鈉鹽的有色部分為陰離子，無色部分為陽離子，其有色部分為酸性，故稱伊紅為酸性染料。美藍通常為氯鹽是堿性的，美藍的中間產物結晶為三氯化鎂復鹽，其有色部分為陽離子，無色部分為陰離子，恰與伊紅鈉鹽相反。

2、用甲醇作瑞氏染料溶劑，即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶劑，有兩種作用：

（1）甲醇使瑞氏染料中美藍（ M ）與伊紅（ E ）在溶液中離解，可使細胞成分選擇性吸附其中的有色物質而著色。 

（2）甲醇具有強大的脫水力，可將細胞固定在一定形態及增加細胞結構的表面積，提高細胞對染料吸收作用，同時由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升溫，加速染色反應。

3. 瑞氏染液配制：

（1） 瑞氏染液配制： 瑞氏染料 830gm 或 1g

甲醇（ AR ） 500ml 或 600ml

先稱干燥（事先放入溫箱干燥過夜）瑞氏染料放置乳缽內， 用乳棒輕輕 敲碎染料成粉末，再行研磨至聽不到研芝麻聲 即呈細粉末，加少許甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸內顯“一面鏡”光澤，而無染料粉粒沉著，再加較多量甲醇研磨呈一面鏡光亮，靜置片刻，將上層液體倒入一 清潔儲存瓶內（用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重復數次，直至乳缽內染料及甲醇用完為止，搖勻，密封瓶口，存室溫暗處，儲存愈久，則染料溶解、分解就越好，一般儲存 3 個月以上為佳。

（2） 緩沖液：

1） 緩沖液作用：染色對氫離子濃度是十分敏感的，據觀察 pH 值的改變，可使蛋白質與染料形成的化合物重新離解。緩沖液須保持 一定的 pH 使染色穩定， PBS 的 pH 一般在 6.4~6.8 ，偏堿性染料可與緩沖液中 酸基起 中和作用，偏酸性染料則與緩沖液中的堿基起中和作用，使 pH 恒定。

2） 緩沖液配制（ pH6.4~6.8 ，弱酸性）：

　　配方 1 ： 配方 2 ：

　　1% KH2PO4 30ml M/15 KH2PO4 73.5 ml

　　1% Na2HPO4 20ml M/15 Na2HPO4 26.5ml

　　H2O（ 新鮮 ） 加至 1000ml

　　置室溫黑暗處，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染則應報廢。