免疫共沉淀

    一 原理：
    IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的“prorein A"特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法。目前多用精制的prorein A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。
    實驗zui需要注意點就是抗體的性質。抗體不同和抗原結合能力也不同，免染能結合未必能用在IP反應。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。
    其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質。多數的抗原是細胞構成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果。
    再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進行實驗。
    每次實驗之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。欲速則不達，確定好比例很必要。（待續）
    二 準備：
    器械：    微量高速冷凍離心機    移液槍    旋轉盤    電泳設備    vortex震蕩器
    液氮及組織粉碎器    eppentube
    試劑：    細胞或組織    蛋白定量kit    SDS電泳試劑    抗體（單抗時選擇protein G,二抗選擇抗鼠Ig兔血清）    PBS    NaN3    proteinA sapharose
    試劑配制
    抗原蛋白溶解緩沖液
    1.RIPA緩沖液 （zui終濃度）
    1MTris-HCL（PH7.4） 5ml （10mM）
    5MNacl 15ml （150mM）
    0.5M EDTA（PH7.4） 5ml （5mM）
    20%TritonX-100 25ml （1%）
    10% DOC 50ml （1%）
    10%SDS 5ml （ o.1%）
    TLCK 18.5mg （0.1mM）
    TPCK 35mg （0.2mM）
    DDW 395ml
    toal 500ml
    另外，使用之前加1mMPMSF（PMSF溶在酒精，濃度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水）
    2.NP40 lysis 緩沖液
    1MTris-HCL（PH7.4） 5ml （10mM）
    5MNacl 15ml （150mM）
    0.5M EDTA（PH7.4） 5ml （5mM）
    20%NP40 25ml （1%）
    TLCK 18.5mg （0.1mM）
    TPCK 35mg （0.2mM）
    DDW 450ml
    toal 500ml
    使用前加1mM的PMSF
    注意點：
    *Tris緩沖劑PH隨溫度變化，高濃度鹽酸滴定時發熱，冷卻后PH增高。
    *反復使用PMSF要注意保管方法。
    *1和2的緩沖劑的區別在于界面活性劑。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和，，DOC
*兩方都有EDTA，對抗原而言，二價離子Mg,Ca等是必要的。根據自己需要調節。EDTA用NaOH滴定。

    Protocol
    1. 調制protein A sapharose
    protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
    離心2000轉2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，離心后去上清，重復2次，zui后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存
    用單抗做一抗時，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清處理（每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清）。旋轉1-2h,混勻后，再離心1-2s去上清后，加PBS，vortex混合，離心去上清，重復二次加含0.02%NaN3的PBS到原來體積，冷存。避免長期保存。
    2．抗原的檢出
    以下操作全在冰面或4度進行去除細胞培養液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，轉移到eppentube中用vortex混勻。RIPA的量：6cm的培養皿加1 ml（蛋白質的量為500mg/ml）,組織塊用液氮粉碎，在緩沖劑中搗勻，蛋白定量。
    30m，15000rpm離心，上清轉移到新tube 。不用移液槍，直接從tube倒進另一個tube
往上清加抗體，1ml加2-5ul抗體，冷室內旋轉混勻1h加protein A sapharose50ul，再混勻1h5000rpm離心1s,使sapharose沉淀，去上清。往sapharose加RIPA，vortex 混勻，離心，去上清。重復4次洗凈。
    加電泳用 sample 緩沖液40ul,2m煮沸，泳動后，固定/干燥膠，現像。
    3.注意點
    A：不熟練使用移液槍，會混入沉淀的不溶性蛋白，使實驗失敗。對無論怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速離心機。
    B：對電泳的非特異條帶，zui后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗凈各一次。（完）