彈性蛋白酶發(fā)酵工藝條件優(yōu)化研究

本研究以我實驗室分離、篩選的彈性蛋白酶產(chǎn)生菌—Pseudomonas sp作為出發(fā)菌株，利用誘變因子的協(xié)同作用，對其進行了誘變育種，得到酶活力較高的菌株P(guān)seudomonassp SWU-B；研究了該菌株產(chǎn)彈性蛋白酶的動態(tài)變化過程；比較了不同的營養(yǎng)源與生長條件對菌株產(chǎn)彈性蛋白酶的影響，優(yōu)化、確定了菌株產(chǎn)彈性蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基；探討了菌株發(fā)酵產(chǎn)彈性蛋白酶的影響因素；初步確定了菌株發(fā)酵產(chǎn)彈性蛋白酶的工藝參數(shù)，結(jié)果如下： 1．三種不同的誘變因子對Pseudomonas sp菌體細胞的致死作用表現(xiàn)出相似的趨勢，在一定范圍內(nèi)都與誘變劑量呈線性正相關(guān)，存活曲線呈指數(shù)型的“肩型”。利用紫外線（UV）、氯化鋰（LiCl）和甲基磺酸乙酯（EMS）復合誘變的協(xié)同效應(yīng)，在UV（2537~*10~（-10）m，30cm處，輻照60s）、EMS浸泡45min后，涂布于含有0.3％LiCl的脫脂奶營養(yǎng)瓊脂平板（NSM）上。在協(xié)同誘變條件下，多輪反復誘變Pseudomonas sp后，菌株的酶活力有所提高，篩選到了彈性蛋白酶活力單位提高了35.49％的菌株—Pseudomonas sp SWU-B。誘變因子的復合、協(xié)同誘變，可以減弱單一誘變劑反復誘變產(chǎn)生的誘變抗性和飽和性，是一種有效的選育優(yōu)良菌株的方法。 2．復合碳源有利于假單胞菌SWU-B （Pseudomonas sp SWU-B）產(chǎn)彈性蛋白酶；碳氮比（C／N）低的營養(yǎng)源，發(fā)酵液的zui終pH=8.2±0.4，利于彈性蛋白酶的產(chǎn)生和活性的穩(wěn)定。葡萄糖、蔗糖混合碳素為營養(yǎng)源時，菌株產(chǎn)彈性蛋白酶的能力優(yōu)于單一的碳源，能夠促進菌株產(chǎn)生彈性蛋白酶；干酪素是產(chǎn)彈性蛋白酶的*氮源。試驗結(jié)果表明：菌株SWU-B在營養(yǎng)組分為（g／L）：葡萄糖，1％；蔗糖，3％；干酪素，3％；Na_2HPO_4，0.3％；MgSO_4.7H_2O，0.01％；pH=7.2的液體培養(yǎng)基中能夠較大限度地產(chǎn)生彈性蛋白酶。 3．Pseudomonas sp SWU-Bzui適生長溫度為37℃，16h進入生長穩(wěn)定期，在此時菌株開始大量的產(chǎn)生、分泌彈性蛋白酶；在28℃、150rpm振蕩、12h種子液、4％接種量時，利于菌體產(chǎn)彈性蛋白酶，24h時達到產(chǎn)酶高峰。 4．菌體細胞壁膜的滲透性對彈性蛋白酶的分泌有較大的影響，發(fā)酵液中Tween80為0.2％（v／w）時能有效地促進酶的產(chǎn)生分泌；青霉素通過破壞細胞壁中的肽聚糖，改變細胞膜、壁的結(jié)構(gòu)，能增加菌體的通透性，促進彈性蛋白酶 中文摘要 的分泌，其具體機制需要進一步研究。 5．彈性蛋白酶的親和底物能激活 Pseudomonas Sp SWU－B菌體產(chǎn)彈性蛋白酶 的機制，促進彈性蛋白酶的產(chǎn)生。彈性蛋白、大豆分離蛋白均能誘導酶的產(chǎn) 生。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 0．40％（w／w）的大豆分離蛋白，能較好的誘導菌體產(chǎn)彈 性蛋白酶。酪氨酸、精氨酸能促進酶的產(chǎn)生，0刀1％的酪氨酸效果較好。 6．補加碳源、氮源和分段變溫培養(yǎng)利于菌體產(chǎn)生彈性蛋白酶，在 12h時補 加一倍的營養(yǎng)源、改變培養(yǎng)溫度能有效的促進酶的產(chǎn)生。添加消泡劑，改善了 菌體的生長環(huán)境，有利于彈性蛋白酶的產(chǎn)生。以花生油為消泡劑時，0．3％的添 加量效果較佳。 7．在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，Pseudomonas Sp SWU習經(jīng) 24h五批次發(fā)酵后，原 發(fā)酵液平均酶活力達到 28UhaL，zui高達到 32U／inL，發(fā)酵液經(jīng)鹽析《NH4） 劣O＊和透析，酶的比活力達到 100U／mg．蛋白質(zhì)，其潛在的開發(fā)價值較大。