細胞凋亡的檢測方法

細胞凋亡的檢測方法

一、形態學觀察方法

1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有“出芽”現象。

2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。

4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。

二、DNA凝膠電泳

（一）、檢測原理

細胞發生凋亡或壞死，其細胞DNA均發生斷裂，細胞內小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質內出現DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規律的發生在核小體之間，出現180－200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的死亡，并可與壞死細胞區別。

（二）結果判斷

正常活細胞DNA 電泳出現階梯狀（LADDER）條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續性條帶。

三、酶聯免疫吸附法（ELISA）核小體測定

凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。

（一）檢測步驟

1、將凋亡細胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體

2、在微定量板上吸附組蛋白體

3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合

4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合

5、加酶的底物，測光吸收制。

（二）用途

該法敏感性高，可檢測5*100/ml個凋亡細胞?？捎糜谌?、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能測定凋亡細胞發生的絕多對量。