酶聯免疫吸附檢測法ELISA試劑盒測定植物激素含量

酶聯免疫吸附檢測法ELISA試劑盒測定植物激素含量
一、原理
植物激素（planthormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶聯吸附免疫分析（ELISA），由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一種類型。在ELISA中，抗原抗體反應的檢測依靠酶標記物來實現，常用的酶有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酯酶。酶可直接標記激素分子，稱為酶標植物激素，也可標記于第二抗體（識別抗
激素抗體Fc片段的抗體或金葡萄球菌A蛋白），稱為酶標二抗。這兩類標記物分別用于固相抗體型和固相抗原型ELISA。A.固相抗體型ELISA：將抗激素的單克隆抗體（Mab）與已吸附于固相載體上的兔抗鼠Ig抗體（RAMIG）結合，然后加入激素標準品或待測樣品，使其與固相化的Mab結合，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記激素
（酶標激素）。通過測定酶標激素的被結合量，可換算出未知樣品中激素的數量。B.固相抗原型ELISA：將“激素-蛋白”復合物（該蛋白應不同于免疫原中的載體蛋白）包被于固相載體，加入待測激素（樣品或標準品）和抗IAA多克隆抗體（Pab）反應，進行競爭反應。然后讓HRP標記羊抗兔Ig
抗體（HRP-GARIG）與結合在固相上的Pab反應，通過測定與固相結合的酶量，換算出未知樣品中激素的含量。
二、材料、儀器設備及試劑
（一）材料：高等植物、真菌、藻類等組織或器官。
（二）儀器設備：
1. 酶聯免疫檢測儀；
2. 高速冷凍離心機；
3. 恒溫箱；
4. 連續進樣器；
5. 渦旋儀；
6. 96孔微孔板；
7. 離心管；
8. 研缽或勻漿器；
9. 試管。
（三）
試劑
1. 洗滌緩沖液：0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液（PBS），含0.05％Tween-0；
2. RAMIG溶液，或“激素-蛋白”復合物；
3. 0.1％封閉蛋白（該蛋白應不同于免疫原中的載體蛋白）；
4. 抗激素Mab，或Pab；
5. 激素標準品母液，及參比系列溶液 （按雙倍或四倍系列稀釋）；
6. HRP標記激素，或HRP-GARIG；
7. 鄰苯二胺（OPD）基質液：5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS，用前加入30％H2O12.5μl 
三、實驗步驟
固相抗體型ELISA試劑盒。
1. 用方陣法滴定選擇各反應物zui適工作濃度；
2. 將100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反應板微孔，4℃濕盒，12h；
3. 棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；
4. 加入100μl抗激素Mab溶液，37℃70min；
5. 棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；
6. 各孔內依次加入50μl待測樣液，每個樣品3次重復，15～20℃，20min；
7. 加入50μlHRP標記激素，37℃，60min；
8. 棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；